懸(xuan)浮(fu)細(xi)胞總是在(zai)孵抗(kang)體和洗的時候(hou)被沖掉，懸(xuan)浮(fu)細(xi)胞做(zuo)免疫熒(ying)光怎么(me)固定？

傳統方法

實驗步驟：

1. 細(xi)胞(bao)在(zai)冰浴(yu)中冷卻(que)，然后用臺(tai)式離心機于4℃以(yi)800 g 離心5 min，吸去培養液(ye)并以(yi)4℃PBS重懸細(xi)胞(bao)。

2. 離(li)心吸(xi)去PBS，以1~2 ml 2%PFA固定液，或2%PFA固定液/0.1% Triton X-100重(zhong)懸(xuan)細(xi)胞，置冰上固定30 min。

3. 離心(xin)、吸去(qu)固定液，用15 ml 4℃ PBS重懸細(xi)胞(bao)，放5 min 后，用PBS再次洗滌細(xi)胞(bao)。

4. 稀釋的第一抗(kang)體于4℃用微(wei)量離(li)心機以13 500 g 離(li)心2 min，250 μl 抗(kang)體足夠用于5x106細胞(bao)。

5. 離(li)心細胞，吸(xi)去PBS，重懸細胞于第(di)一抗體中，置(zhi)4℃溫育(yu)1 h。

6. 用(yong)4℃ PBS稀(xi)釋細胞和抗體至15 ml。

7. 離心，吸去PBS，以4℃ PBS重懸細胞，重復1次(ci)。

8. 第(di)二抗(kang)(kang)體4℃用微量(liang)離(li)心機以13 500 g 離(li)心2 min，5x106細胞用250 ul 抗(kang)(kang)體足夠。

9. 吸(xi)去(qu)PBS，以第二抗體(ti)重(zhong)(zhong)懸細胞，4℃溫育1 h，重(zhong)(zhong)復步驟6及步驟7。

10. 除(chu)非(fei)立即觀察細(xi)(xi)胞，否則在進行細(xi)(xi)胞濃(nong)縮的下(xia)一步操作之前應(ying)以鋁萡包裹離心(xin)管并冷藏。

11. 離心細胞并以少量PBS重懸（勿用水(shui)），將細胞懸液滴于多聚-L-賴氨酸覆層(ceng)的載玻(bo)片上(shang)，加上(shang)蓋玻(bo)片，盡可(ke)能馬(ma)上(shang)觀察結(jie)果。 

鏡(jing)下觀察：沒有(you)細胞，原來掉片了(le)！！！

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